本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，HPLC法作为分析方法，检测奶粉中维生素D₂、D₃的残留。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。

二、实验目标物

维生素D₂(CAS: 50-14-6)、维生素D₃(CAS: 67-97-0)。

三、应用范围

本方法适用于奶粉、滴剂中维生素D₂、D₃残留的HPLC检测及确证。

四、参考标准

《GB5009.82-2016食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》。

五、实验材料

HuaXue-Bio 2000 mg/12 mL(Cat. No. SLBSIL122000)。

六、实验方法

1、样品提取
1.1 奶粉固体样品处理
准确称取2.0 g奶粉置于50 mL离心管中，加入5 mL柠檬酸水溶液（200 g/L），4 mL二甲基亚砜，5 mL甲醇，于振荡器中振荡10 min，再加15 mL提取液（正己烷：甲基叔丁基醚=1:1，v/v）振荡10 min，在4000 r/min下离心5 min，取上清液；向离心管中重新加10 mL提取液，重复提取一次，合并两次上清液，于50 °C下氮吹至近干，加入5 mL正己烷重新溶解，备用。

1.2 滴剂液体样品处理
取滴剂胶囊一粒，从中剪开置于50 mL离心管中，加入10 mL提取液（乙酸乙酯：正己烷=1:9，v/v）于振荡器振荡提取10 min，上清液转移，向离心管中再加10 mL提取液，重复提取一次，合并两次上清液，备用。

2、SPE柱净化
(1)活化：Silica柱使用前用10 mL乙酸乙酯活化，10 mL正己烷平衡。
(2)上样和洗脱：取备用液加入固相萃取柱中，弃去流出液；取5 mL淋洗液（乙酸乙酯：正己烷=5:95）分两次淋洗，弃去流出液；抽干小柱；取20 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，于50 °C氮吹至近干（整个上样、洗脱过程控制流速在1 mL/min内）。
(3)重新溶解：加1 mL甲醇重新溶解、混匀，经0.22 μm滤膜过滤，供上机测试。

3、HPLC条件
设备：Waters Alliance 2695
色谱柱：HuaXue-Bio C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)
检测器：Waters 2996 DAD 紫外检测器
检测波长：268 nm
流动相：甲醇：水=98：2
流速：1.0 mL/min
进样体积：20 μL

七、实验结果

1、1.25 mg/kg各基质中维生素D₂、D₃的添加回收结果
表1 1.25 mg/kg各基质中维生素D₂、D₃的添加回收结果

2、添加水平为1.25 mg/kg维生素D₂、D₃检测的液相色谱图


 

图1 添加水平为1.25 mg/kg维生素D₂、D₃检测的液相色谱图

结论：本方法平均回收率为89.9 %，RSD为4.3 %，满足标准要求。